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維生素B1（Vitamin B1，VB1）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法

50管/48樣 注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。 測(cè)定意義 維生素B1（Vitamin B1）是構(gòu)成脫羧輔酶的主要成分，參與細(xì)胞代謝中的三羧酸循環(huán)，是維持機(jī)體正常代謝必須的水溶性維生素，在生物體能量代謝中有重要的作用。 測(cè)定原理 VB1在堿性條件下還原。。。。。。。。。與Fe3+在弱酸條件下生成普魯士藍(lán)，在704nm有特征吸收峰。 自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器 天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、1 mL玻璃比色皿、蒸餾水。 試劑組成和配制 提取液：液體35mL×1瓶，4℃保存。 試劑一：液體1mL×1瓶，4℃保存。 試劑二：液體5mL×1瓶，4℃保存。 試劑三：液體5mL×1瓶，4℃避光保存。 試劑四：液體12mL×1瓶，4℃保存。 試劑五：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。 樣本處理
1. 組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，13000g離心10min，取上清測(cè)定（動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘）。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入0.6mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，13000g離心10min，取上清測(cè)定。
3. 血清：直接測(cè)定。
測(cè)定操作
空白管
測(cè)定管
樣品（μL）
0.1
試劑一（μL）
100
試劑二（μL）
80
80
試劑三（μL）
100
100
充分混勻，80℃反應(yīng)10min
提取液（μL）
80
80
試劑四（μL）
220
220
試劑五（μL）
120
120
H2O（μL）
300
300
充分混勻，靜置20min，于1mL玻璃比色皿，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定704nm處吸光值，記為A空白管和A測(cè)定管，△A=A測(cè)定管-A空白管。
計(jì)算公式 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.1902x - 0.1833，R2 = 0.9991 1. 按照蛋白含量計(jì)算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反總÷（V樣×Cpr） = 52.58×（△A +0.1833）÷ Cpr 2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算 VB1含量（μg/g）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反總÷（V樣×W÷V樣總） = 52.58×（△A +0.1833）÷ W 3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 VB1含量（μg/104 cell）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總） = 52.58×（△A +0.1833）÷ 細(xì)胞數(shù)量 4. 按照液體體積計(jì)算 VB1含量（μg/mL）=（△A +0.1833）÷ 0.1902×V反總÷V樣 = 52.58×（△A +0.1833） V反總：反應(yīng)總體積，1mL；：V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL； Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g 注意事項(xiàng)
1. 若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過(guò)1，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2. 蛋白濃度較高的樣品，比如動(dòng)物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再測(cè)定，在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3. 顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。

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